Sviluppo ed applicazione di workflows di N-tail terminomics per la caratterizzazione di eventi proteolitici di rilevanza patologica in patologie oculari

Anno di Riferimento 5X1000: 2022

Inizio Progetto: 01/01/2024

Fine Progetto: 31/12/2025

Sintesi Progetto – Abstract: Le patologie di pertinenza oftalmologica, quali il glaucoma, la retinopatia diabetica, l’age-related macular generation (AMD), il distacco retinico, nonché patologie corneali (ad es. sindrome di Fuchs), hanno un significativo impatto per la qualità di vita del paziente, nonché per i costi sociali ed economici a carico dei sistemi sanitari nazionali. Sebbene la patogenesi segua traiettorie differenti, così come diversi sono i tessuti oculari affetti, l’insorgenza, ma anche la progressione, di queste malattie è accomunata da alterazioni del rimodellamento dei tessuti extracellulari oculari. Tuttavia, come già per molte patologie umane a carico di altri distretti anatomici, i meccanismi molecolari alla base di questi processi sono scarsamente noti.  In virtù di tali considerazioni, una fine caratterizzazione dei frammenti proteolitici endogeni, ovvero peptidi rilasciati da digestione enzimatica di proteine, all’interno di fluidi oculari, quali l’umor acqueo e vitreo, rappresenta un promettente approccio per identificare fenomeni di degradazione enzimatica specifici per il fenomeno patologico in esame. Infatti, il verificarsi di eventi proteolitici di rilevanza patologica a carico di tessuti oculari, quali trabecolato, strati retinici, tessuti corneali, può essere ricostruito, con un ragionevole margine di affidabilità, esaminando i frammenti peptidici dei due fluidi, umor acqueo e vitreo nel corso di analisi comparative tra campioni isolati da soggetti affetti da una specifica malattie e pazienti di controllo (definiti sulla base della patologia in esame). In aggiunta, esplorare il repertorio di frammenti proteici in campioni di natura cellulare, quale quelli identificabili in campioni di endotelio corneale, può fornire importanti parametri per correlare l”origine del frammento peptidico ed il tessuto di appartenenza. In virtù della ridotta concentrazione di proteine, e di peptidi, all’interno dei fluidi in questione, approcci sperimentali ad elevata sensibilità rappresentano l’unica soluzione tecnologica per fornire una risposta alla problematica scientifica posta.   In tal senso, la spettrometria di massa è senz’altro l”approccio più indicato per ottenere una copertura del dato biologico più ampia possibile. Strategie classiche (“shot-gun”) di proteomica per la caratterizzazione del proteoma di una matrice biologica prevedono la frammentazione delle proteine in essa contenuta tramite digestione con tripsina prima di iniettare il campione nello spettrometro di massa. Tale strumento esegue quindi la caratterizzazione della massa (e carica) dei peptidi presenti in soluzione. L’identificazione è seguita da approcci bioinformatici necessari per risalire all’identificazione delle proteine presenti in soluzione. Tuttavia, tale approccio non consente di distinguere in maniera ottimale frammenti peptidici derivanti da proteolisi endogena da quella triptica artificiale. Al fine di caratterizzare i frammenti proteolitici endogeni sono stati quindi elaborati specifici workflows di proteomica, quale l’N-tail terminomics cui tale progetto si riferisce. Concettualmente, l’approccio si basa sulla marcatura chimica, in vitro, di tutte le estremità N-terminali di proteine e peptidi presenti in soluzione prima della digestione con tripsina. In tal modo, frammenti peptidici endogeni possono essere protetti chimicamente da ulteriori eventi di digestione con tripsina in vitro e caratterizzati tramite approcci convenzionali di spettrometri di massa.

Data percezione fondi 5xmille: 28/09/2023

Costo complessivo del progetto: 29.703,73

Totale quote 5 x mille: 29.703,73

Rendiconto di assegnazione risorse 5×1000 2022: 

• Scheda economica iniziale di spesa fondi
• Scheda riassuntiva di assegnazione risorse
• Relazione illustrativa del progetto

Dalla pratica clinica al laboratorio: un percorso inverso per la ricerca di biomarcatori nel distacco di retina e sviluppo di colture cellulari con l’utilizzo di fluidi oculari

Anno di Riferimento 5X1000: 2021

Inizio Progetto: 01/03/2023

Fine Progetto: 31/01/2024

Sintesi Progetto – Abstract: La medicina traslazionale è una branca interdisciplinare del campo biomedico fondata su tre pilastri principali: “benchside, bedside e community”.

In questo ambito, la medicina personalizzata o di precisione ha l’obbiettivo di fornire il giusto trattamento al paziente giusto, ma soprattutto nel momento giusto. Negli ultimi anni, questo obbiettivo è stato migliorato grazie all’avanzamento delle tecnologie nella genomica, dei sistemi di modelli di malattia e di molti altri paradigmi seguiti dalla scienza dei dati. Fondamentale è stato ottenere una prospettiva sistemica sulla scienza, integrata da competenze molteplici e

multidisciplinari. L’obbiettivo di questo progetto è, in primis, quello di raccogliere dati grazie ad un cross-talking tra le unità operative direttamente impegnate nella cura del paziente in sala operatoria per le patologie della retina e il laboratorio di ricerca. Pertanto, partendo direttamente dal paziente, dalla sua malattia e dal profilo clinico si ripercorre in maniera inversa il classico percorso “bench-to-bedside”.

Nello specifico, una parte del progetto (Parte A) sarà dedicata all¿analisi del proteoma in pazienti con distacco di retina primario. Questa ha l’obbiettivo di comparare il repertorio delle proteine presenti nel corpo vitreo, con particolare attenzione all’identificazione di mediatori della flogosi e di identificare possibili biomarker di patologia che possano essere correlati con parametri clinici di gravità ed estensione. Nella seconda parte, invece, lo studio (Parte B) prevede la caratterizzazione e validazione di un modello in vitro costituito da cellule epiteliale della capsula anteriore/posteriore esposta a microambiente patologico (diabete, ipertensione ed altre patologie di carattere sistemico) per poter approfondire le conoscenze della biologia delle cellule epiteliali native e il ruolo meccanicistico che svolgono nelle patologie della retina.

Data percezione fondi 5xmille: 23/09/2022

Costo complessivo del progetto: € 31.892,40

Totale quote 5 x mille: € 31.892,40
Rendiconto di assegnazione risorse 5×1000 2021: 

• Scheda economica iniziale di spesa fondi
• Scheda riassuntiva di assegnazione risorse
• Relazione illustrativa del progetto

Caratterizzazione molecolare e funzionale del sistema ubiquitina proteasoma durante il danno ipossico in un modello sperimentale di glia di Muller

Anno di Riferimento 5X1000: 2020

Inizio Progetto: 01/02/2022

Fine Progetto: 31/01/2024

Sintesi Progetto – Abstract: La retinopatia diabetica (RD) ed il glaucoma, due tra le principali cause di cecità irreversibile a livello globale, rappresentano due patologie degenerative oculari con diversa eziologia, la cui progressione clinica è caratterizzata da insulti di tipo ischemico-ipossico, su base vascolare, neuro-infiammatoria e meccanica. Pertanto, l’ipossia è uno stress con un ruolo centrale nell’innescare le alterazioni morfologiche e funzionali cui la retina ed il nervo ottico sono sottoposte. Tuttavia, i meccanismi molecolari, nonché il contributo di ciascun istotipo cellulare retinico alla percezione ed adattamento a questo stress metabolico sono scarsamente caratterizzati.    L’ipossia è nota attivare molteplici pathways intracellulari, tra cui, l’Hipoxia-Inducible Factor (HIF), che modula la risposta pro-angiogenetica tramite la sintesi ed il rilascio di VEGF, e NF-kB, il principale pathway proinfiammatorio che regola la sintesi ed il rilascio di citochine proinfiammatorie.Al contempo, è noto come il pre-condizionamento ipossico, inteso come transitoria esposizione ad un evento ipossico di modesta entità, costituisca un meccanismo protettivo attraverso il quale la cellula acquisisce una maggiore capacità di tollerare un successivo evento ipossico più severo. I fattori molecolari coinvolti in questo meccanismo non sono noti, ma rappresentano un promettente obiettivo di ricerca per la definizione di trattamenti terapeutici e preventivi di eventi ischemici.  L’adattamento ad insulti di tipo metabolico, tra i quali l’ipossia, nonché l’acquisizione di specifiche proprietà fenotipiche, quale la resistenza a determinati fattori ambientali, sono primariamente regolate attraverso un pathway proteolitico intracellulare noto come sistema ubiquitina proteasoma (UPS), già oggetto di approfonditi studi finalizzati a comprendere le basi molecolari della neurodegenerazione e ad individuare strategie terapeutiche non convenzionali. In particolare, la coniugazione delle proteine intracellulari con l’ubiquitina, una piccola proteina con funzioni chiave nella regolazione del proteoma cellulare ed in grado di indirizzare la localizzazione nonché l’emivita di ogni proteina cellulare, rappresenta un’interessante e largamente inesplorata area di studio per comprendere come la cellula sia in grado di adattare il proprio metabolismo in risposta agli stimoli ambientali cui è sottoposta.  Pertanto, scopo del presente progetto è allestire una piattaforma sperimentale, basata su una specifica tecnica di proteomica di recente allestimento, nota come diGLY proteomics, per individuare determinanti molecolari coinvolti nella riposta ipossica e nel condizionamento pre-ipossico tramite indagine del repertorio dell’ubiquitina in un modello sperimentale di glia di Muller, cellule rMC1, sottoposte ad ipossia controllata e pre-condizionamento ipossico in vitro. L’high-throughput strategy che caratterizza l’approccio proposto suggerisce che sarà possibile identificare la presenza di numerose alterazioni funzionali del sistema UPS nelle condizioni sperimentali oggetto di indagine che potranno quindi consentire di individuare nuovi targets biologici. In parallelo, viene proposta un’indagine proteomica di caratterizzazione del repertorio dell’ubiquitina anche nell’umor acqueo di pazienti affetti da glaucoma e retinopatia diabetica (pazienti affetti da cataratta verranno utilizzati come controlli sani) al fine di valutare la possibile presenza di determinanti molecolari correlati all’eterogeneità dell’ubiquitina anche in fluidi biologici oculari.

Data percezione fondi 5xmille: 19/10/2021

Costo complessivo del progetto: € 35.735,24

Totale quote 5 x mille: € 35.735,24
Rendiconto di assegnazione risorse 5×1000 2020: 

• Scheda economica iniziale di spesa fondi
• Scheda riassuntiva di assegnazione risorse
• Relazione illustrativa del progetto Hypoxia

Modulazione della connettività neuronale lungo le vie ottiche nei pazienti glaucomatosi: studio morfo-funzionale multimodale

Anno di Riferimento 5X1000: 2019

Inizio Progetto: 01/04/2021

Fine Progetto: 30/03/2023

Sintesi Progetto – Abstract: Il glaucoma ad angolo aperto (OAG) è considerato come un processo neurodegenerativo del nervo ottico che determina deficit del campo visivo (CV). Nel OAG sono presenti modificazioni delle cellule ganglionari retiniche (RGCs) e delle fibre del nervo ottico (RNFL) rilevabili dell’Optical Coherence Tomography (OCT). I deficit funzionali delle RGCs e del nervo ottico possono essere valutati rispettivamente tramite la registrazione di ERG da Pattern (PERG) e dei Potenziali Evocati Visivi (PEV). Il deficit funzionale post-retinico può essere stimato tramite un indice elettrofisiologico: il Tempo Retino-Corticale (RCT). Studi di neuro imaging hanno evidenziato nei pazienti glaucomatosi una perdita neuronale a livello delle strutture delle vie ottiche post-retiniche (Nucleo Genicolato Laterale- NGL- e corteccia visiva). Nei pazienti glaucomatosi è stato osservato che la Citicolina riduce la progressione del deficit perimetrico glaucomatoso attraverso meccanismi di azioni di: 1) neuropotenziamento, migliorando la funzionalità delle RGCs; 2)      neuroprotezione, riducendo della perdita delle RGCs, 3) neuromodulazione, migliorando la connettività sinaptica tra RGCs e NGL. Gli scopi del presente progetto di ricerca saranno: 1) Obiettivo Primario: valutare se il trattamento con Citicolina in soluzione orale possa produrre un miglioramento della conduzione nervosa post-retinica, alterata di base nei pazienti con OAG. 2)Obiettivo secondario: valutare nei pazienti con OAG se le possibili modificazioni della conduzione nervosa post-retinica indotte dal trattamento con Citicolina in soluzione orale (informazioni ottenute attraverso le registrazioni elettrofisiologiche) siano associabili o meno a variazioni morfologiche e funzionali delle strutture nervose che formano le vie ottiche (NGL, tratto ottico, corteccia visiva, informazioni ottenute attraverso l’acquisizione di risonanza magnetica strutturale e funzionale) e se entrambe le condizioni possano essere in relazione con le variazioni morfo-funzionali delle RGCs e del CV. Lo studio sarà condotto in doppio cieco, su 60 pazienti con glaucomatosi, randomizzati in due gruppi: un gruppo sarà trattato con Citicolina in soluzione orale, mentre l’altro gruppo sarà trattato con placebo per una durata totale di 12 mesi. In condizione basale, dopo 6 e 12 mesi su tutti i pazienti arruolati, saranno valutate le seguenti variazioni: della conduzione nervosa post-retinica (attraverso la registrazione simultanea di PERG e PEV), della condizione morfologica delle strutture nervose che formano le vie ottiche (tramite valutazioni di neuro-imaging-RMI) e delle RGCs (tramite OCT), del deficit perimetrico (valutazione del CV).  I risultati attesi sono i seguenti: 1) per ciò che riguarda l’obiettivo primario, il risultato atteso è che la Citicolina in soluzione orale possa migliorare la conduzione nervosa post-retinica. 2) Per ciò che riguarda gli obiettivi secondari il risultato atteso consiste nella possibilità di rilevare che eventuali miglioramenti della conduzione nervosa post-retinica dopo trattamento con Citicolina in soluzione orale possano essere associati o meno a cambiamenti della struttura e della funzione delle stazioni nervose che formano le vie ottiche (valutate tramite RMI) dipendentemente o indipendentemente dalla condizione morfo-funzionale delle RGCs e del CV. Le ricadute cliniche possono così riassumersi: 1) Allo stato attuale, lo scopo principale terapeutico nella malattia glaucomatosa è quello di ridurre la pressione oculare che viene considerato il principale fattore di rischio per la genesi dei deficit perimetrici. 2)Poter evidenziare che il trattamento con Citicolina, in base alle proprie varie azioni (neuropotenziamento, neuroprotezione e neuromodulazione) possa essere in grado di modulare la connettività neuronale,pone delle basi per una maggiore comprensione dei deficit della connettività neuronale e del suo possibile miglioramento con conseguente riduzione del deficit perimetrico glaucomatoso.

Data percezione fondi 5xmille: 30/09/2020

Costo complessivo del progetto: € 153.588,12

Totale quote 5 x mille: € 53.588,12
Rendiconto di assegnazione risorse 5×1000 2019: 

• • Scheda economica iniziale di spesa 2019
  • Scheda riassuntiva di assegnazione risorse
  • Relazione illustrativa del progetto

Studio del ruolo dei pathways proteolitici intracellulari, UPS ed autofagia, nella patogenesi della retinopatia diabetica e del glaucoma

Anno di Riferimento 5X1000: 2018

Inizio Progetto: 03 Gennaio 2021

Fine Progetto: 30 Gennaio 2023

Sintesi Progetto – Abstract: Un precedente studio molecolare in vitro su un modello cellulare di glia di Muller di ratto (cellule rMC1) ha consentito di documentare una rapida (entro 30 minuti) e non convenzionale (indipendente dalla fosforilazione di IkBα, l’inibitore naturale del pathway) attivazione del principale pathway proinfiammatorio, NF-kB, e specificatamente dell’etero-dimero p65-p50, in seguito a somministrazione di 25 mmol/L glucosio (condizione sperimentale di iperglicemia). Lo scopo di questa ricerca è dimostrare che il pathway descritto in grado di determinare l’attivazione della glia di Muller in vitro sia riproducibile ed operante anche in un sistema cellulare a complessità aumentata, quale la coltura retinica primaria. Obiettivo della seguente proposta di ricerca è analizzare, attraverso un approccio multidisciplinare di biochimica, biologia molecolare ed immunoistochimica, il ruolo dell’asse Calmodulina Ca2+ dipendente (CamKII) proteasoma nel determinare l’attivazione funzionale, in senso proinfiammatorio, della glia di Muller, nel contesto di una coltura primaria retinica, in presenza di uno stimolo iperglicemico (25 mmol/L D+ glucosio).

Data percezione fondi 5xmille: 12 Giugno 2020

Costo complessivo del progetto: € 56.506,35

Totale quote 5 x mille: € 56.506,35
Rendiconto di assegnazione risorse 5×1000 2018: 

• • Scheda economica iniziale di spesa 2018
  • Scheda riassuntiva di assegnazione risorse
  • Relazione illustrativa del progetto